1樓:蘇素
影響感受態細胞bai轉化du效率的因素及zhi實際操作過程中應注意的事dao項:
1.細菌的內生長狀態:實驗中應容密切注視細菌的生長狀態和密度,儘量使用對數生長期的細胞(一般通過檢測od600來控制。dh5α菌株 od600為 0.
5 時細胞密度是 5 × 107/ml );
2.所有操作均應在無菌條件和冰上進行;
3.經 cacl2處理的細胞,在低溫條件下,一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加, 24小時達到最高,之後轉化率再下降(這是由於總的活菌數隨時間延長而減少造成的);
4.化合物及無機離子的影響:在 ca2+的基礎上聯合其他二價金屬離子(如 mn2+或 co2+)、 dmso 或還原劑等物質處理細菌,可使轉化效率大大提高( 100-1000 倍);
5.所使用的器皿必須乾淨。跡量的去汙劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率;
6.質粒的大小及構型的影響:用於轉化的應主要是超螺旋的 dna ;
7.一定範圍內,轉化效率與外源 dna 的濃度呈正比;
要提高質粒的轉化效率, 實驗中要考慮幾個重要因素?求大神賜教
2樓:匿名使用者
一般要考慮以下幾點 1. 細胞生長狀態和密度: 不要用經過多次轉接或儲於4°C的培養菌,最好從-70°C或-20°C甘油儲存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。
細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好,可通過監測培養液的od600 來控制。dh5α菌株的od600 為0.5時,細胞密度在5×107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。
密度過高或不足均會影響轉化效率.
2. 質粒的質量和濃度: 用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態dna(cccdna)。
轉化效率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比,但當加入的外源dna的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng的cccdna即可使50μl 的感受態細胞達到飽和。一般情況下,dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%。
3. 試劑的質量: 所用的試劑,如cacl2 等均需是最高純度的(gr.或ar.),並用超純水配製,最好分裝儲存於乾燥的冷暗處。
4. 防止雜菌和雜dna的汙染:整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,並經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、dna酶或雜dna所汙染, 否則均會影響轉化效率或雜dna的轉入, 為以後的篩選、鑑定帶來不必要的麻煩。
更多實驗問題可以諮詢中洪博元。
影響感受態細胞製備的因素有哪些
3樓:淵源
1.細菌的生長狀態:實驗中應密切注視細菌的生長狀態和密度,儘量使用對數生長期的細胞(一般通過檢測od600來控制。dh5α菌株 od600為 0.
5 時細胞密度是 5 × 107/ml )。
2.所有操作均應在無菌條件和冰上進行。
3.經 cacl2處理的細胞,在低溫條件下,一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加,24小時達到最高,之後轉化率再下降(這是由於總的活菌數隨時間延長而減少造成的)。
4.化合物及無機離子的影響:在 ca2+的基礎上聯合其他二價金屬離子(如 mn2+或 co2+)、 dmso 或還原劑等物質處理細菌,可使轉化效率大大提高( 100-1000 倍)。
5.所使用的器皿必須乾淨。跡量的去汙劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率。
6.質粒的大小及構型的影響:用於轉化的應主要是超螺旋的 dna。
7.一定範圍內,轉化效率與外源 dna 的濃度呈正比。
採用cohen方法制備高感受態細胞取決於哪些因素
4樓:匿名使用者
1、感受態細胞的質量,比如超級感受態比普通感受態轉化效率高很多;
2、質粒濃度及質量,連線產物因為質粒濃度低,純度低轉化效率比純的質粒低很多;
3、轉化條件,如熱激冷激的溫度時間等;
4、活化培養的條件,soc培養基優於lb培養基;
5、塗布用的培養基及抗生素濃度等。
擴充套件資料:
製作方法
cacl2法
1、將快速生長的大腸桿菌置於經低溫(0°C)預處理的低滲氯化鈣溶液中,便會造成細胞膨脹,同時ca離子會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構,促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來,離開所在區域,誘導細胞成為感受態細胞
細胞膜通透性發生變化,極易與外源dna相粘附並在細胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣複合物。
聯合其它的二價金屬離子(如mn、co)、dmso或還原劑等物質處理細菌,則可使轉化率提高100~1000倍。
2、此時,將該體系轉移到42°C下做短暫的熱刺激(90s),細胞膜的液晶結構會發生劇烈擾動,並隨機出現許多間隙,外源dna就可能被細胞吸收。進入細胞的外源dna分子通過複製、表達,實現遺傳資訊的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。
3、將轉化後的細胞在選擇性培養基上培養,篩選出帶有外源dna分子的陽性克隆。
電轉法電擊法不需要預先誘導細菌的感受態,依靠短暫的電擊,促使dna進入細菌,轉化率最高能達到109~1010轉化子/ug閉環dna。因操作簡便,愈來愈為人們所接受
意義將構建好的載體轉入感受態細胞進行表達,不僅可以檢驗重組載體是否構建成功,最主要的是感受態細胞作為重組載體的宿主可以進行後續實驗,如蛋白質表達純化等工作。
感受態細胞的轉化要注意些什麼
5樓:匿名使用者
注意事項:
1.實驗中所需氯化鈣於冰浴後再使用
2.使用離心機前,要嚴格保證離心物品充分平衡,以免造成離心機損傷3.大腸桿菌感受態一定放冰上溶化
4.熱激和冰浴時間要科學把握
6樓:匿名使用者
此外(1)質粒dna的質量和濃度,環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍,則會使轉化率下降;ml左右,且注意防止被其它試劑。(應注意od600值與細胞數之間的關係隨菌株的不同而不同),大於30kb的重組質粒將很難進行轉化:所用的cacl2等試劑均需是最高純度的。
對tg1菌株。所有的試劑都要滅菌。對於以質粒為載體的重組分子而言:
用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態的,並經高壓滅菌處理,1ng的cccdna即可使50ul的感受態細胞達到飽和。一般地。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳,所用器皿,並用最純淨的水配製,細胞密度在5×107個/:
整個操作過程均應在無菌條件下進行,分子量大的轉化效率低,移液槍頭等最好是新的,不能離開冰浴,重組dna分子的構型與轉化效率也密切相關,否則細胞轉化率將會降低,可通過測定培養液的od600控制、dna酶或雜dna所汙染,轉化率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比。密度過高或不足均會使轉化率下降。不要用已經過多次轉接。
(二)感受態細胞轉化中的影響。(2)感受態細胞的質量。整個操作均需在冰上進行,但當加入的外源dna的量過多或體積過大時,dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%,實驗證明,及貯存在4°C的培養菌液,因此重組dna大都構成環狀雙螺旋分子,最好分裝儲存於4°C (3)細胞的生長狀態和密度 最好從-70°C或-20°C甘油儲存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。
即應用對數期或對數生長前期的細菌,否則均會影響轉化效率或雜dna的轉入,od600為0.5時,如離心管
分子實驗報告根據本實驗認為影響轉化率的因素有哪些
7樓:雙槍老椰子
(1)、受體細胞
轉化的受體細胞一般是限制-修飾系統缺陷的突變株,即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株,它可容忍外源dna分子進入體內並穩定地遺傳給後代。
另外還應根據載體的性質及實驗的目的選擇合適的宿主。
此外,受體細胞生長狀態和密度也很重要。不要使用經過多次轉接或儲存於4°C的培養菌。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好,密度過高或不足均會影響轉化率。
(2)、載體dna和重組dna方面
載體本身性質決定了轉化的高低,不同的載體dna轉化同一受體細胞,其轉化效率不同。載體的空間構象也有明顯影響,超螺旋結構的載體質粒往往有較高的轉化率,經體外酶切連線操作後的載體dna或重組dna由於空間上難以恢復,其轉化率常比cccdna低兩個數量級。對以質粒為載體的重組分子而言,分子量大的轉化效率低。
(3)、操作方面
感受態細胞的製備對轉化率影響較大。一般未經特殊處理的培養細胞對重組dna分子不敏感,難以轉化成功。為防止雜菌和雜dna的汙染,整個操作均應在無菌條件下進行,所有器皿最好是新的,並經高壓滅菌處理,所有試劑也都要滅菌處理。
(4)、轉化體系中重組dna的濃度與純度
轉化體系中重組dna的濃度與純度對轉化率也有一定影響。在一定濃度範圍內,濃度越高,轉化率越高,重組dna純度越高,轉化率越高。
(5)、外源基因與宿主染色體的同源性
外源基因**與宿主親緣關係越近,越易整合到宿主染色體中,轉化率越高,否則易被宿主核酸酶降解而降低轉化率。
大腸桿菌感受態和農桿菌感受態的選擇
除非你的實驗目的一定要求你要用農桿菌，或者是最後一步要轉基因了，否則，大腸桿菌更好，因為它的商業化各種都很齊全，想要什麼就有什麼。大腸桿菌dh5a感受態細胞與大腸桿菌bl21感受態細胞有什麼區別 首先，這兩種菌的基因型不一樣，這就導致了這兩種菌有不同的用途 dh5a是用於克隆的，構建質粒，建庫，保藏...
電轉化的感受態能用試劑盒製備嗎,感受態可以再擴增用來製備感受態嗎
應該可以的把 不是有 電轉感受態細菌製備試劑盒嘛 那你這個應該也沒有問題啊 幾種感受態細胞製備 的效果比較 20 1 將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4 C下3000g離心10分鐘。2 棄去上清,用預冷的0.05mol l的cacl2溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15 30分鐘後,...
農桿菌感受態製備為什麼要加NaCl
應該是保持內的滲透壓,保持細胞的正常形態,因為na和cl是細胞物質運輸的重要離子 應該是加cacl2吧 為的是增加農桿菌細胞壁的通透性 農桿菌感受態的製備為什麼要冰浴 樓上別扯了,那是為了讓細胞膜流動性降低,利於dna的結合,同時使細胞暫停生長,維持在對數生長期的高活性 使它的細胞壁變薄,易於質粒的...