1樓:樂研_統統
樣品需要加入上樣緩衝液後在100度煮沸10分鐘使蛋白變性後冷卻,
12000rpm 10分鐘離心,取上清上樣,不然會堵孔。
希望能幫到你!
2樓:空山竹林
您做的是哪一類凝膠電泳?
核酸凝膠電泳不需要加熱。
蛋白非變性凝膠電泳一般也不必加熱。
蛋白變性凝膠電泳需要煮沸5-10分鐘變性。
不同的凝膠電泳需求不同。
3樓:匿名使用者
實驗樣品不需要加熱的
電泳為什麼是要將樣品煮沸5分鐘
4樓:匿名使用者
sds-page電泳你做的是變性電泳,也就是加sds,並需要沸煮的. 在沸煮過程中,蛋白樣品必然變性由原來的球狀變成線性,但是形成的時候蛋白質-sds複合物,所以不會沉澱.這種複合物在凝膠中遷移率只跟蛋白質分子量大小有關,所以能進行蛋白的分離鑑定.
marker一般都是預變性的也就是預煮過的,所以可以不用再煮了.
電泳前蛋白煮沸 重複實驗時還需要煮嗎
5樓:匿名使用者
重複試驗時不需要煮沸。
蛋白煮沸變性之後是不能再復性的了,所以煮沸一次之後想重複實驗的話不需要煮沸了。
蛋白電泳一般指聚丙烯醯胺凝膠電泳,它有兩種形式:非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(native-page)及sds-聚丙烯醯胺凝膠(sds-page);非變性聚丙烯醯胺凝膠,在電泳的過程中,蛋白質能夠保持完整狀態,並依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。而sds-page僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。
6樓:匿名使用者
電泳前蛋
白煮沸,重複實驗時當然需要煮
電泳前蛋白煮沸是為了能讓蛋白和上樣緩衝液中的sds更好的結合,已消除蛋白本身電荷的影響。重複實驗要跑電泳,當然也需要在電泳前將蛋白煮沸。一般重複實驗就是要重複各個實驗步驟,以免最終結果出現差異
瓊脂糖凝膠電泳常見問題有哪些
7樓:匿名使用者
用瓊脂或瓊脂糖作支援介質的一種電泳方法。對於分子量較大的樣品,如大分子核酸、病毒等,一般可採用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳常見為題都有哪些?
dna帶模糊
dna降解:瓊脂糖凝膠電泳試驗中要避免核酸酶汙染
電泳緩衝液陳舊:電泳緩衝液多系使用後,離子強度降解,ph值上升,緩衝能力減弱,從而影響電泳實驗,建議經常更換電泳緩衝液。
所用電泳條件不合適:電泳時電壓不應超過20v/cm,溫度<30°C;巨大dna鏈電泳,溫度應該<15°C;檢車所有電泳緩衝液是否有足夠的緩衝能力
dna上揚量過多:應減少凝膠中dna上樣量。
dna樣含鹽量過高:電泳前通過乙醇沉澱去除過多的鹽。
有蛋白汙染:電泳前酚抽提去除蛋白
不規則dna帶遷移
對於λ/hindiii片段cos位點復性:電泳前於65°C加熱dna5分鐘,然後在冰上冷卻5分鐘。
電泳條件不合適:電泳電壓不超過20v/cm;溫度<30°C;經常更換電泳緩衝液。
dna變性:以20mm naci buffer稀釋dna,電泳前勿加熱。
帶弱或無dna帶
dna的上樣量不夠:增加dna的上樣量;聚丙烯醯胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳靈敏度稍高,上樣量可適當降低。
dna降解:避免dan的核酸酶汙染
dna走出凝膠:縮短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度。
對於eb染色的dna,所用光源不合適:應用短波長(254mm)的紫外光源
dna帶缺失
小dna帶走出凝膠:縮短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度。
分子大小相近的dna帶不易分辨:增加電泳時間,核准正確的凝膠濃度。
dna變性:電泳前請勿高溫加熱nda鏈,以20mm naci buffer稀釋dna
dna鏈巨大,常規凝膠電泳不合適:在脈衝凝膠電泳上分析。
綜上所訴,瓊脂糖凝膠電泳實驗需注意以下幾點:
1.體系配製時候最關鍵的幾個試劑一定要確定它們還有效、或者還沒被汙染:引物,酶,超純水。
這些東西最好自己收好,寫上個人的名字放好,冰盒上記得帶上橡皮筋,這樣就不會因為別人翻冰箱時候把你的冰盒碰散了,試劑都碰掉。否則,你的試劑被汙染了,到時候陰性對照狂出條帶,再去找汙染源很麻煩。而且配置體系時候要注意保持實驗區的乾淨,事先可用小噴壺進行酒精噴霧,固定空氣中的dna,而且全程要戴手套,避免汙染體系。
2.pcr體系要摸準,最好用人家都做得很多的老體系來上手。
3.要想得到漂亮的電泳圖,可以在pcr開始時候就把膠倒上(前提是你的pcr總時間在1.5小時左右,並且1.
5小時候之後你還在實驗室。),讓凝膠涼著,這樣凝膠的上樣孔會比較規則,膠體裡面的其本身的孔徑也會較規則。如果你要第二天再跑膠,千萬記得把pcr完畢的樣本放入4°C儲存。
第二天做時候建議把膠涼上25分鐘左右。
4.瓊脂糖凝膠電泳上樣時候建議使用排槍上樣,不僅快速而且樣本加到膠孔裡的速度一致。當然,排槍上樣最好選用進口槍頭,國產槍頭就不要想了。
5.不管電泳室使用的頻率高還是低,我都建議每次瓊脂糖凝膠電泳時候更換電泳液,避免出現「^」形條帶。
瓊脂糖凝膠電泳marker的作用
瓊脂糖凝膠電泳marker的作用是分子標記。dna分子標記具有的優越性有 大多數分子標記為共顯性，對隱性性狀的選擇十分便利 基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的 在生物發育的不同階段，不同組織的dna都可用於標記分析 分子標記揭示來自dna的變異 表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性...