1樓:匿名使用者
染色質免疫沉澱被bai用來研究細du胞內dna與蛋白質相互作zhi用,具體來dao說就是確定特定蛋白(如內轉錄因子容)是否結合特定基因組區域(如啟動子或其它dna結合位點)——可能定義順反組。
chip還被用來確定基因組上與組蛋白修飾相關的特定位點(即組蛋白修飾酶的靶標)。 此方法的簡要過程是:細胞裂解液裡的蛋白和相關染色質暫時結合;染色質(dna)-蛋白複合物被剪下,與所研究蛋白相關的dn**斷被選擇性免疫沉澱;相關dn**斷被純化,順序被測定。
一般認為這些dna順序在活體內與所研究蛋白結合 。
什麼是染色質免疫共沉澱技術(chip)?
2樓:一碗湯
染色質免疫共沉澱技術是在保持組蛋白和dna聯合的同時,通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體,染色質被切成很小的片斷,並沉澱下來的技術。
這項技術主要用來分析目標基因有沒有活性、或者分析一種已知蛋白**錄因子)的靶基因有哪些。該技術主要應用於以下幾方面:
1.組蛋白修飾酶的抗體作為「生物標記」
2.轉錄調控分析
3.藥物開發研究
4.有絲**研究
5.dna損失與凋亡分析
擴充套件資料:
實驗步驟:
1、細胞固定
甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質,蛋白質-dna,蛋白質-rna交聯,形成生物複合體,防止細胞內組分的重新分佈。甲醛的交聯反應是完全可逆的,便於在後續步驟中對dna和蛋白質進行分析。交聯所用的甲醛終濃度為1%,交聯時間通常為5分鐘到1個小時,具體時間根據實驗而定。
值得注意的是,交聯時間如果過長,細胞染色質難以用超聲波破碎,影響chip結果,而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯時間如果過短,則交聯不完全,產生假陰性。甲醛的交聯反應可被加入的甘氨酸終止。
2、染色質斷裂
交聯後的染色質可被超聲波或micrococcal nuclease切成400~600 bp的片段(用瓊脂糖凝膠電泳檢測),以便暴露目標蛋白,利於抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質,容易引起升溫或產生泡沫,這都會引起蛋白質變性,進而影響chip的效率。
所以在超聲波斷裂染色質時,要在冰上進行,且要設計時斷時續的超聲程式,保證低溫。另外,超聲探頭要儘量深入管中,但不接觸管底或側壁,以免產生泡沫。總超聲時間也不要太長,以免蛋白降解。
技術應用:
1、micrococcal nuclease可以將染色質切成一到幾個核小體,比超聲波處理的結果更精緻,更均一。另外,酶反應的條件比較溫和,對dna和dna-蛋白複合物的損傷較小,而且蛋白不易變性。酶處理染色質適用於新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品。
在研究組蛋白時,經常採用沒經過甲醛固定的native chip(n-chip)的研究方法。
因為n-chip沒經過甲醛固定,超聲波處理會打斷組蛋白和dna的結合,所以只能選擇酶處理染色質的方法。對於甲醛固定的樣品,一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。
2、染色質免疫沉澱的dna適用於多種分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要驗證的,可採用狹縫雜交(slot blot)的方法,把靶序列特異性探針與染色質免疫沉澱的dna雜交,來驗證目的蛋白與dna靶序列的特異性結合。
還可以根據靶序列設計引物,用半定量pcr的方法進行測定,或採用real-time pcr方法進行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的(high-throughput),可採用southern雜交。但因為免疫沉澱的dna量較少,所以在研究時通常要用pcr方法擴增dna探針,再進行整個基因組掃描。
3、目前,隨著人類基因組測序工作的基本完成,研究目的蛋白和整個基因組的相互作用逐漸成為研究的熱點。由於基因組中的資訊量非常大,上述常規方法通常無法滿足科研的需要。近年來發展起來的chip-chip技術將基因組dna晶片(chip)技術與染色質免疫沉澱技術(chip)相結合,為研究目的蛋白與整個基因組相互作用提供了可能。
chip-chip 技術通過標記染色質免疫沉澱富集的dn**段,和另一個被標記不同探針的對照組樣品一起,與dna晶片雜交,再利用各種生物資訊學方法對收集到的訊號進行分析,具體的實驗步驟請參考dr. richard young在nature protocols上的文章。
chip-chip技術已經被廣泛應用於研究轉錄因子在整個基因組中的訊號網路,染色質修飾機制在基因組中的調控,dna的複製,修復以及修飾,基因的轉錄與核運輸等諸多方面。
4、染色質免疫沉澱技術還可用於分析兩種蛋白共同結合的dna序列,即chip rechip方法。chip rechip是在第一次chip的基礎上不解交聯,而繼續進行另一個目的蛋白的免疫沉澱,從而得到與兩種目的蛋白都結合的dna序列。
值得注意的是,因為通過兩次免疫沉澱富集的dna量比較少,所以在分析時通常要把多次免疫沉澱的dna濃縮後再進行操作。
5、隨著染色質免疫沉澱技術受到廣泛的關注,運用該技術發表的文章也逐漸增多,大家越來越多的開始關注如何改進chip的方法。millipore最新推出的magna chip試劑盒,利用磁珠分離dna-蛋白-抗體複合物,提高了chip的效率,簡化了操作的過程,縮短了實驗的時間,還為同時進行多個目的蛋白的研究提供了可能,是經常使用chip技術的研究人員的理想選擇。
6、近年來chip技術也被用於研究rna-蛋白的相互作用,其原理與dna類似,也包括甲醛固定,超聲波破細胞,免疫沉澱,交聯逆轉,rna純化和rna鑑定等步驟。所不同的是,交聯逆轉只用proteinase k,要進行rna純化和不含rnase的dnase處理,分析時用rt-pcr,晶片雜交要用cdna晶片等。
3樓:匿名使用者
染色質免疫沉澱(chip)實驗指南及技術總結
chip是一項比較流行的研究轉錄因子(transcriptionfactor,tf)與啟動子(promoter)相互結合的實驗技術。由於chip採用甲醛固定活細胞或者組織的方法,所以能比較真實的反映細胞內tf與promoter的結合情況。當用甲醛處理時,相互靠近的蛋白與蛋白,蛋白與核酸(dna或rna)之間會產生共價鍵。
細胞內,當tf與promoter相互結合(生物意義上的結合)時,它們必然靠的比較近,或者契合在一起,這個時候用甲醛處理,能使它們之間產生共價鍵。
染色質免疫沉澱分析(chip)是基於體內分析發展起來的方法,它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質-dna複合物,並通過超聲或酶處理將其隨機切斷為一定長度範圍內的染色質小片段,然後通過抗原抗體的特異性識別反應沉澱此複合體,特異性地富集目的蛋白結合的dn**段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與dna相互作用的資訊。它能真實、完整地反映結合在dna序列上的調控蛋白,是目前確定與特定蛋白結合的基因組區域或確定與特定基因組區域結合的蛋白質的一種很好的方法。chip不僅可以檢測體內反式因子與dna的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關係。
而且,chip與其他方法的結合,擴大了其應用範圍:chip與基因晶片相結合建立的chip-on-chip方法已廣泛用於特定反式因子靶基因的高通量篩選;chip與體內足跡法相結合,用於尋找反式因子的體內結合位點;rna-chip用於研究rna在基因表達調控中的作用。
一般chip的流程是:甲醛處理細胞---收集細胞,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-dna複合物相互結合---加入proteina,結合抗體-靶蛋白-dna複合物,並沉澱---對沉澱下來的複合物進行清洗,除去一些非特異性結合---洗脫,得到富集的靶蛋白-dna複合物---解交聯,純化富集的dna-片斷---pcr分析。
在pcr分析這一塊,比較傳統的做法是半定量-pcr。但是現在隨著熒光定量pcr的普及,大家也越來越傾向於q-pcr了。此外還有一些由chip衍生出來的方法。
例如rip(其實就是用chip的方法研究細胞內蛋白與rna的相互結合,具體方法和chip差不多,只是實驗過程中要注意防止rnase,最後分析的時候需要先將rna逆轉錄成為cdna);還有chip-chip(其實就是chip富集得到的dna-片段,拿去做晶片分析,做法在chip的基礎上有所改變,不同的公司有不同的做法,要根據公司的要求來準備樣品)。
第一天:
(一)、細胞的甲醛交聯與超聲破碎。
1、取出1平皿細胞(10cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的終濃度為1%(培養基共有9ml)。
2、37攝氏度孵育10min。
3、終止交聯:加甘氨酸至終濃度為0.125m。450 ul 2.5m甘氨酸於平皿中。混勻後,在室溫下放置5min即可。
4、吸盡培養基,用冰冷的pbs清洗細胞2次。
5、細胞刮刀收集細胞於15ml離心管中(pbs依次為5ml,3ml和3ml)。預冷後2000rpm 5min收集細胞。
6、倒去上清。按照細胞量,加入sds lysis buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個細胞。
這樣每100ul溶液含1×106個細胞。再加入蛋白酶抑制劑複合物。假設mcf7長滿板為5×106個細胞。
本次細胞長得約為80%。即為4×106個細胞。因此每管加入400ul sds lysis buffer。
將2管混在一起,共800ul。
7、超聲破碎:vcx750,25%功率,4.5s衝擊,9s間隙。共14次。
(二)、除雜及抗體哺育。
8、超聲破碎結束後,10,000g 4oc離心10min。去除不溶物質。
留取300ul做實驗,其餘儲存於-80oc。
300ul中,100ul加抗體做為實驗組;100ul不加抗體做為對照組;100ul加入4ul5mnacl(nacl終濃度為0.2m),65oc處理3h解交聯,跑電泳,檢測超聲破碎的效果。
9、在100ul的超聲破碎產物中,加入900ulchipdilutionbuffer和20ul的50×pic。
再各加入60ulproteinaagarose/salmonspermdna。4oc顛轉混勻1h。
10、1h後,在4oc靜置10min沉澱,700rpm離心1min。
11、取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul抗體,另一管中則不加抗體。4oc顛轉過夜。
(三)、檢驗超聲破碎的效果。
取100ul超聲破碎後產物,加入4ul5mnacl,65oc處理2h解交聯。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。
第二天:
(一)、免疫複合物的沉澱及清洗。
12、孵育過夜後,每管中加入60ulproteinaagarose/salmonspermdna。4oc顛轉2h。
13、4oc靜置10min後,700rpm離心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉澱複合物。清洗的步驟:加入溶液,在4oc顛轉10min,4oc靜置10min沉澱,700rpm離心1min,除去上清。
洗滌溶液:a.low salt wash buffer-one wash
b.highsalt wash buffer-one wash
c.licl wash buffer-one wash
d.te buffer-two wash
15、清洗完畢後,開始洗脫。洗脫液的配方:100ul10%sds,100ul1mnahco3,800ulddh2o,共1ml。
每管加入250ul洗脫buffer,室溫下顛轉15min,靜置離心後,收集上清。重複洗滌一次。最終的洗脫液為每管500ul。
16、解交聯:每管中加入20ul 5m nacl(nacl終濃度為0.2m)。
混勻,65oc解交聯過夜。
第三天:
(一)、dna樣品的**
17、解交聯結束後,每管加入1ulrnasea(mbi),37oc孵育1h。
18、每管加入10ul0.5medta,20ul1mtris.hcl(ph6.5),2ul10mg/ml蛋白酶k。
45oc處理2h。
19、dn**段的**----omega膠**試劑盒。最終的樣品溶於100ulddh2o。
(二)、pcr分析
染色質是否會發生纏繞？為什麼，染色質是否會發生纏繞？為什麼？
也許這個有用 為什麼書本上說 間期，染色體解開螺旋，呈細絲狀 染色質形態 解螺旋不是發生在末期的麼？末期是螺旋變短變粗誒。如果你是高中生，奉勸一句，別管課外自己學到的，不要管課外資料書上的，就以書為準，否則高考等著哭吧。希望我的解答對你有幫助，如果有，請及時採納。染色體與染色質作用 染色質經過盤曲摺...
染色質的超微結構，染色質的超微結構
1.核小體來 nucleosome 核小體是染自色體的基本結構單位。2.螺線體 solenoid 核小體鏈呈螺旋形纏繞，並形成超微螺旋，稱為螺線體。3.超螺線體 super solenoid 超螺線體是染色體的 結構。4.染色體超螺線體再進一步摺疊，盤繞就形成了染色體 實際上是染色單體 真核生物的染...
染色質上為什麼有蛋白質染色質中的蛋白質都是組蛋白嗎
染色質是指間期細胞內由dna 組蛋白 非組蛋白及少量rna組成的線性複合結構，是間期細胞遺傳物質存在的形式，染色體是指細胞在有絲 或減數 過程中，由染色質聚縮而成的棒狀結構。染色質蛋白質 染色質dna結合蛋白有兩類，即組蛋白和非組蛋白。1 組蛋白 組蛋白呈鹼性。真核生物染色體的組蛋白有5種，即h1 ...