1樓：匿名使用者
因為每一個德爾塔ct其實是擴大了2倍啊，123之間並不是123，而是248
pcr ct值越高是否說明表達越低，△ct值越高說明表達也低，是嗎？
2樓：匿名使用者
如果有標準曲線，按照標準曲線計算。
一般都是相對量。則用delta delta ct方法來計算。舉例如下：
對照組基因a的ct值為20， 內參（比如βactin)ct值15。實驗組基因a ct值18，內參ct值14。
首先算加樣量：delta ct=15-14=1。2的1次方是2。也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。
基因a: delta ct=20-18=2。2的2次方是4。也就是說基因a的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。
幾點注意：
1。必須確定擴增的特異性
2。 只有相同目標的ct值才能相減（擴增效率有可能不同）
3。 2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2。
4。 最好不用syber green
3樓：匿名使用者
你參考一下我以前的回答
關於實時熒光pcr檢測2-△△ct計算結果？
4樓：塗含秀扶紹
這個很簡單啊。你做了一次實驗，得到的樣本做了一次pcr，得到了一次的相對定量（設對照組為1）。然後重新做實驗，再做pcr，又得到一組，這樣至少重複3次，就有3組相對定量了。計算標準差
對照組的標準差：取對照組的平均ct值設為1，
3次試驗的ct值根據2-△△ct計算相對量，可以算出對照組的標準差。
如何區分共振能量轉移和靜態複合物形成引起的熒光強度下降
5樓：匿名使用者
標準曲線按照標準曲線計算
般都相量則用delta delta ct計算舉例： 照組基act值20 內參
（比βactin)ct值15實驗組基a ct值18內參ct值14 首先算加量：delta ct=15-14=1212說
建議查下資料
感覺問題主意不是很清晰
q-pcr的幾個問題？
6樓：阿魯巴星人
1 可以先平均再求差值，也可以先差值再平均。兩種方式的variation應該是一樣的。
2 可以去掉，但是少於3個的樣品沒有統計學上的意義。你可以自己看看。
1 看內參和目的基因的ct值沒有問題
2 對數期的線條應該是比較漂亮的，前頭的不好看正常。很有軟體有美化這些線條的功能，所以會很漂亮，這個不用太在意，只要你的ct值重複孔是一樣的就好。
熒光定量pcr裡的相對定量裡算delta deltact的對照組是什麼？
7樓：匿名使用者
你都有標準曲線了。就不用做delta deltact了，直接用樣本的ct值帶入標準曲線就可以了。
delta deltact只用於相對值的測量。每一個delta代表ct值相減一次。第一次是目標基因對照組和實驗組的ct值相減。第二次是內參基因對照組和實驗組ct值相減。
得到的兩個數值算為2的xx次方，就是相差了多少倍。再用目的基因的倍數除以內參基因的倍數，最後得到實際的相差倍數。
pcr的原理是什麼 的原理是什麼，它有什麼用途
8樓：匿名使用者
pcr全稱多聚酶鏈式反應，原理是dna的體外擴增。
具體來說：在ep管里加入dna、合成原料（dntp、引物）、耐熱的dna聚合酶（taq）後，放入pcr儀，pcr儀會利用升溫使dna變性，在聚合酶的作用下使單鏈複製成雙鏈，進而達到基因複製的目的。
用途：1、核酸的基礎研究：基因組克隆
2、不對稱pcr製備單鏈dna用於dna測序3、反向pcr測定未知dna區域
4、反轉錄pcr（rt-pcr）用於檢測細胞中基因表達水平、rna病毒量以及直接克隆特定基因的cdna
5、熒光定量pcr用於對pcr產物實時監控6、cdna末端快速擴增技術
7、檢測基因的表達
8、醫學應用：檢測細菌、病毒類疾病；診斷遺傳疾病；診斷腫瘤；應用於法醫物證學
9樓：匿名使用者
pcr技術必須有人工合成的合理引物和提取的樣品dna，然後才進行自動熱迴圈，最後進行產物鑑定與分析。引物設計與合成目前只能在少數技術力量較強的研究院、所進行，臨床應用只需購買pcr檢測試劑盒就可開展工作，pcr自動熱迴圈中影響因素很多，對不同的dna樣品，pcr反應中各種成份加入量和溫度迴圈引數均不一致。現將幾種主要影響因素介紹如下。
一、溫度迴圈引數
在pcr自動熱迴圈中，最關鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作範例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個迴圈，擴增片段500bp。
在這裡，每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度後開始計算。在自動熱迴圈儀內由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s，這一遲滯時間的長短取決於幾個因素，包括反應管型別、壁厚、反應混合液體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩步驟間的溫度差，在設定熱迴圈時應充分給以重視和考慮，對每一儀器均應進行實測。
關於熱迴圈時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應時間是按最適於合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。
1．模板變性溫度變性溫度是決定pcr反應中雙鏈dna解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈dna模板，pcr也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，dna雙鏈會很快復性，因而減少產量。一般取90～95℃。
樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。dna變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應儘量縮短，以保持taq dna聚合酶的活力，加入taq dna聚合酶後最高變性溫度不宜超過95℃。
2．引物退火溫度退火溫度決定pcr特異性與產量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，dna擴增效率下降；溫度低產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。一般先由37℃反應條件開始，設定一系列對照反應，以確定某一特定反應的最適退火溫度。也可根據引物的（g+c）%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度ttm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算：
ta = tm - 5℃= 4(g+c)+ 2(a+t) -5℃
其中a，t，g，c分別表示相應鹼基的個數。例如，20個鹼基的引物，如果（g+c）%含量為50%時，則ta的起點可設在55℃。在典型的引物濃度時（如0.
2μmol/l）,退火反應數秒即可完成，長時間退火沒有必要。
3．引物延伸溫度溫度的選擇取決於taq dna聚合酶的最適溫度。一般取70～75℃，在72℃時酶催化核苷酸的標準速率可達35～100個核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長度，其速度取決於緩衝溶液的組成、ph值、鹽濃度與dna模板的性質。
擴增片段如短於150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫迴圈，因taq dna聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對於100～300bp之間的短序列片段，採用快速、簡便的雙溫迴圈是行之有效的。此時，引物延伸溫度與退火溫度相同。
對於1kb以上的dn**段，可根據片段長度將延伸時間控制在1～7min，與此同時，在pcr緩衝液中需加入明膠或bsa試劑，使taq dna聚合酶在長時間內保持良好的活性與穩定性；15%～20%的甘油有助於擴增2.5kb左右或較長dn**段。
4．迴圈次數常規pcr一般為25～40個週期。一般的錯誤是迴圈次數過多，非特異性背景嚴重，複雜度增加。當然迴圈反應的次數太少，則產率偏低。
所以，在保證產物得率前提下，應儘量減少迴圈次數。
擴增結束後，樣品冷卻並置4℃儲存。
二、引物引物設計
要擴增模板dna，首先要設計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶dna序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5』端決定擴增產物的兩個5』末端位置。由此可見，引物是決定pcr擴增片段長度、位置和結果的關鍵，引物設計也就更為重要。
引物設計的必要條件是與引物互補的靶dna序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為15～20個鹼基，可以用dna合成儀合成與其對應互補的二條引物，除此之外，引物設計一般遵循的原則包括：
1．引物長度根據統計學計算，長約17個鹼基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現的機率的為1次。因此，引物長度一般最低不少於16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸，最佳長度為20～24個核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應溫度（通過72℃）下不會形成穩定的雜合體。
有時可在5』端新增不與模板互補的序列，如限制性酶切位點或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5』端生物素標記或熒游標記可用於微生物檢測等各種目的。
有時引物不起作用，理由不明，可移動位置來解決。
2．（g+c）%含量引物的組成應均勻，儘量避免含有相同的鹼基多聚體。兩個引物中（g+c）%含量應儘量相似，在已知擴增片段（g+c）%含量時宜接近於待擴增片段，一般以40%～60%為佳。
3．引物內部應避免內部形成明顯的次級結構，尤其是髮夾結構（hairpin structures）。例如：
4．引物之間兩個引物之間不應發生互補，特別是在引物3』端，即使無法避免，其3』端互補鹼基也不應大於2個鹼基，否則易生成「引物二聚體」或「引物二倍體」（primer dimer）。所謂引物二聚體實質上是在dna聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈dn**段，是pcr常見的副產品，有時甚至成為主要產物。
另外，兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續6個以上相同鹼基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣，引物與待擴增靶dna或樣品dna的其它序列也不能存在6個以上鹼基的同源序列。否則，引物就會與其它位點結合，使特異擴增減少，非特異擴增增加。
5．引物3』端配對dna聚合酶是在引物3』端新增單核苷酸，所以，引物3』端5～6個鹼基與靶dna的配對要求必須精確和嚴格，這樣才能保證pcr有效擴增。
引物設計是否合理可用pcrdesn軟體和美國primer軟體進行計算機檢索來核定。
人工合成的寡核苷酸引於最好經過色譜（層析）純化或page純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質。純化引物在25%乙腈溶液中4℃儲存可阻止微生物的生長；一般情況下，不用的引物應儲存在-20℃冰箱中，在液體中引物能儲存6個月，凍幹後可儲存1～2年。
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