求助菌液pcr跑了好幾次都是陽性,測序卻沒有訊號

1樓:南京金益柏生物科技****

可能你的菌液不是單克隆,還有可能你的目的片段有重複序列,形成髮夾結構。

菌液pcr的時候能p出目的條帶,為什麼測序卻完全不正確

2樓:v永遠拼搏

有可能是引物特異性不好或者細菌細胞雜質所帶來的假陽性~得到的條帶有可能是混合的~建議測序分析模板用提取的核酸做模板......若還是不對請重新設計引物或採用巢式pcr

菌落pcr檢測有條帶,但是測序結果根本沒有連上,是什麼原因

3樓:匿名使用者

菌落baipcr的假陽性很多,也有du很多原因,所以一zhi般都是需要測序結果佐證的。

dao1,引物設計不合適專:選擇的擴增屬序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行 pcr 擴增時,擴增出的 pcr 產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。

需重新設計引物。

2,靶序列或擴增產物的交叉汙染:這種汙染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉汙染,導致假陽性。

這種假陽性可用以下方法解決:操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。

所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸汙染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。

可互相拼接,與引物互補後,可擴增出 pcr 產物,而導致假陽性的產生,可用巢式 pcr 方法來減輕或消除。

[菌液pcr,測序,dna提取,求助]菌液pcr的時候能p出目的條帶,為什麼測序卻完全不正確?

4樓:匿名使用者

菌落pcr的假陽性高很可能是因為你做pcr的迴圈數過大,我們實驗室一般對於高拷貝數的質粒,迴圈數不會超過25個,一般用25個。我知道一家做這些,[威斯騰生物]。感覺還可以

5樓:阿魯巴星人

菌液pcr經常會出現假陽性,最好以測序結果為準(測序引物啥的別弄錯哈~)。

6樓:匿名使用者

菌液pcr假陽性高,應該以測序結果為準

做單克隆測序是菌液好還是菌液pcr後測好

7樓:匿名使用者

菌液pcr有風險,因為pcr是有一個級聯放大的效應在裡專面,只要在菌液屬中沾了一點轉化時用的核酸片段,就有可能會擴增出來。但是送去測序的時候,很可能是假陽性,沒有連入任何片段(以前我們就碰到過這種情況,而且還是通過藍白斑篩選的)。

如果實在沒有iptg和x-gal,也最好能先挑幾個單菌落去做菌落pcr,從中選取陽性的菌落去做液體搖菌,提質粒,找一個目標判斷上有的酶做一個單切,同時用自連的空載作為對照,看是否能夠切開。如果菌體克隆切開了,空載切不開,才能說明找到了陽性克隆。送去測序才比較可靠。

否則直接送去測序,很可能全是空載,白白耽誤時間。

為了節省時間,也可以先送去測序,等待測序的過程中,進行酶切驗證,對了更好,不對趕緊找其他的菌去送樣。