1樓:匿名使用者
其實菌落baipcr的條件與常du規pcr區別不大。如果前面取菌體zhi的時候處理dao得比較徹底的回話,例如煮沸,離答心,取上清作為模板,那幾乎可以沿用常規pcr條件。
但是對於有一些模板容易引起非特異擴增,或者是干擾pcr反應的時候,需要考慮提高退火溫度,或者降低模板濃度。
菌落pcr跑出2條帶怎麼回事
2樓:
又陰性對照,陽性對照,有目標帶的話,
幾條帶不重要,
因為只是檢查有沒有而已,不用取優化pcr,浪費時間。
菌落pcr會出現假陽性結果嗎
3樓:匿名使用者
高手們好。最近做酶切連線轉化,最後做鑑定時,以菌落為模板進行pcr時可以見到有目的條帶;當把菌落接種到lb液擴菌後,以菌液為模板進行pcr時卻什麼東東都沒有?請問會是什麼原因啊?
多多指教啊!建議重新以菌落為模板進行pcr檢測,再重新以菌液為模板進行pcr檢測,因為菌落或者菌液pcr假陽性的機率還是比較高的。但如果還是出現以上結果,推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的,此時建議再提質粒做pcr檢測和酶切檢測來徹底證明你的目的片段是否真正與載體連線成功。
個人的見解希望對你有所幫助,也期望高手們批評指正!我覺得菌落pcr效果很好,雖然有假陽性的可能,但是只要是做出來,有目的條帶一般是對的,你為什麼還要用菌液做pcr?你還不如搖菌後提取質粒然後用質粒pcr或者酶切。
既然你說到這個問題了,我覺得很有可能是你的質粒被稀釋了,因為在菌落中的濃度比較大。另外也有可能是你根本就沒有挑到正確的菌落來搖菌,所以就沒有質粒,怎麼能做出來。我覺得你做菌液的pcr和菌液的pcr必須是從單一的一個菌落挑出來的,如果不是,那肯定只有一個是正確的,我做過,只要是同一菌落不會有差錯。
你再試試看,祝你成功!謝謝各位高手的及時的回答。現在我都是挑單個菌落後搖菌,然後提取質粒,然後以質粒為模板做pcr,陽性的質粒再酶切進行鑑定,效果還可以。
再次謝謝大家!!!第二次看到這種觀點,不確定對不對,借道跟大家討論一下,不知道lcc有沒有文獻支援一下這種觀點?如果這種觀點正確,那我以前很多關於t載體的看法就錯了,所以很感興趣。
我一直以為外面的dn**段會被大腸桿菌分泌出來的核酸酶降解。 lcc_0 wrote:推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的說來也很奇怪,以前我就是挑菌後加到lb液後搖菌,然後以菌液為模板進行pcr,再以陽性管提取質粒進行酶切鑑定,排除陰性管,這樣可以少提一些質粒。
最近菌液pcr總是陰性,所以就直接提質粒進行鑑定了。其中原因真的不知道是什麼?我也遇到過,也許是塗抹的轉化產物導致的加陽性(菌落pcr)。
各位大大,我倒是碰到過菌液pcr是陰性,但是有質粒的情況,酶切也正確。一般我以為質粒抽屜和酶切鑑定是最保險的。pcr假陽性。
假陰性的概率都很高。菌液的問題在於鹽!鹽會干擾pcr。
如果用菌液的話,可以用水洗滌離心幾次,然後重懸於水,就可以了。 題外話:最近菌落pcr,陰性和陽性對照經常不擴增,而樣品擴增,鬱悶啊。
4樓:匿名使用者
條帶兩端上揚這種情況在跑電泳很常見,一般把電壓調低點跑久點會改善,有時候膠沒有做好也會出現這樣的情況,注意拔梳子的時候一定要平衡。以前做克隆的時候,陰性對照模板用水擴增也出現過有條帶,就像你最後一個泳道。老闆說是汙染了,把所有的試劑全部換新的,而且加樣條件也非常注意,後來就沒有條帶了。
5樓:匿名使用者
菌落pcr的結果參考價值比較下,假陽性太厲害。還是以測序結果為準。可以在測序之前做一下質粒酶切驗證
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