1樓：匿名使用者
1。 挑取菌斑。2ml小量培養過夜。
2。 培養後取1微升菌液作為pcr模板，配製pcr體系。只是要做質粒插入片段鑑定的話，迴圈數20個就足夠了。想用pcr再大量擴增片段的話，那要28個迴圈就好。
3。 電泳檢測。
4。找到陽性克隆，剩餘的菌液可以做質粒小量抽提或保種。
如果只是基於鑑定的目的，直接拿牙籤或槍頭挑點菌斑在pcr體系裡面蘸下就可以做pcr了。
菌落pcr的具體方法
2樓：洗刷刷
1、菌落pcr混合液（通俗稱為pcr mix）的製備
taq buffer（10×） 180ul
dntp（2.5 mm） 20～25 ul
primer forward（引物濃度在10pmol） 5 ul
primer reverse（引物濃度在10pmol） 5 ul
ddh2o 720 ul
taq（2u/ul） 12～15 ul
2、常溫下隨機挑選平板內的單一菌落，用滅菌的牙籤或槍頭挑取單一菌落（強調單一，不能是雙克隆），在lb瓊脂糖平板上輕點，做一拷貝；然後將沾有菌體的牙籤或槍頭置於相應的pcr8聯管中或者96孔pcr反應板中（96孔反應板和挑選的菌落做好記號，如平板上點的是1#，2#，3#……則96空反應板也相應標1#，2#，3#……以便篩選到克隆後的擴大培養），再將挑取的96個單一菌落轉移到48孔板培養基中培養，挑好單克隆菌落轉移之後，由於96孔反應板內沾有挑選的菌落，可以用相應的通用引物和之前配製好的pcr混合液混合好之後加入到96孔反應板內。
3、將混有菌體的pcr混合物置於pcr儀中，按常規條件擴增。
4、在擴增出來的反應液中加入溴酚藍或是其他染料，電泳檢測是否得到目的片斷。如有則為陽性克隆。
5、將已經篩選到的陽性克隆對應96孔反應板上的菌株挑選出來，37度繼續培養達到一定時間可以抽提質粒，測序驗證是否是需要的目的基因
注意事項：設計引物很關鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pet系列可用t7通用引物。
如果是非定向克隆（如單酶切或平末端連線），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑑定了，而且錯誤概率很低。pcr條件的選擇接近最佳，同時挑取的菌體不宜太多，否則會有非特異性擴增。
使用的引物濃度不能太高，濃度過高會導致非特異性擴增，反應的迴圈數也不能太多，一般不超過25個。同時因為擴增的片段的gc含量問題，有的gc含量很低，有的又很高，導致菌落pcr不容易擴增出目的條帶，在此建議在設定pcr程式時以高gc的溫度為上限，每一迴圈降0.2度左右。
48孔板 96孔反應板
菌落pcr的操作步驟及儀器有哪些？
3樓：匿名使用者
1.取15-20ul tris-hcl 放到編好號的0.5ml 的ep管中
2.用滅菌牙籤，或槍頭，沾取少量菌體（多了效果不好）3.並將槍頭或牙籤在剛取出來的tris-hcl中涮一下，可以看到溶液略微變渾濁
4.蓋上管蓋，100c煮沸5-10min
5.離心，取1-2ul上清配製pcr反應體系。如果菌體較多，則取0.5ul就夠了
6.設定pcr儀程式，進行反應
7.結果電泳檢測即可
4樓：匿名使用者
菌落pcr要菌長的足夠大，一半搖菌儲存，另一半做pcr
菌斑一般用滅菌的槍頭在超淨臺挑取即可，在lb（搖菌用）和pcr反應液裡蘸一下即可。
反應液按正常反應體系加就可以，全程在冰上操作，加完後稍離心，然後設定好pcr儀的反應程式，進行反應。結果跑一下電泳即可。
5樓：阿扁床單
1.配置pcr反應體系，分裝於八連管中
2.在超淨臺裡用滅菌牙籤佔取少量菌體，將牙籤放在八連管液體中涮一下
3.設定pcr儀，進行反應
菌落pcr和菌液pcr在原理和操作方面有什麼區別
6樓：匿名使用者
如果轉化成功的話，菌落裡的菌就含有你克隆的質粒載體了，用槍頭直接碰一下，然後作為pcr模板，就可以進行pcr擴增了。但是菌落pcr鑑定的假陽性率其實也不低，所以建議你挑取菌落擴培之後抽提質粒，進行酶切鑑定，這樣比較準確，酶切鑑定確認好之後再去測序以確定沒有鹼基突變或缺失。
你說的t7通用引物是指載體上的t7 promtor引物嗎？那只是一條引物啊，如果加上gbh下游引物的話，擴增出來的就是你連線進去的目的基因的長度了。
菌落pcr怎麼做
7樓：蠢羊羊
如果是革蘭氏陰性菌比如大腸桿菌還好，陽性菌幾乎不能成功，因為有很厚的胞壁沒法破壁。而陰性菌成功率也不是很高，就用牙籤在菌落上挑一點到pcr體系裡。但要考慮的是即使鑑定出轉化子後你怎麼儲存這個菌落？
再回板上找那個被挑過的殘存菌落嗎？與其這樣不如多花幾個小時搖菌液再pcr吧
8樓：匿名使用者
不是特別明白你所提出的問題， 能specific一點嗎？
根據我的理解， 你所說的是在做完transformation之後把接種的細菌塗盤， 其中理論上吞噬表達了目標質粒的細菌可以存活， 第二天當菌種長得肉眼可見的時候， 塗抹一點點用來做目標質粒的pcr， pcr成功的表明實驗成功， 請問你問的是這個問題嗎？
如果是假陽性不高， 基本上是一種用來快速screening的辦法， 就是篩選出很可能成功的菌落。 當然最後的**標準仍舊是miniprep之後做sequencing了。
做法就是統一配master mix， 也就是包含buffer， mgcl2， primer forward, primer reverse， ddntp， taq， 混勻後平均到pcr tube裡面， 之後每個菌落標號號碼， 用tip的尖稍微抹一點點就好了。 注意抹的時候要在本生燈下做， 要小心點避免汙染。 然後按照標號放pcr tube裡面。
之後pcr然後跑膠就ok了。
我在國外讀書， 學的都是英文的， 說的如果不太貼切或者是理解錯誤請見諒。
跑菌落pcr條件如何設定
9樓：匿名使用者
其實菌落baipcr的條件與常du規pcr區別不大。如果前面取菌體zhi的時候處理dao得比較徹底的回話，例如煮沸，離答心，取上清作為模板，那幾乎可以沿用常規pcr條件。
但是對於有一些模板容易引起非特異擴增，或者是干擾pcr反應的時候，需要考慮提高退火溫度，或者降低模板濃度。
酵母菌落pcr怎麼做
10樓：北京索萊寶科技****
菌落pcr就是直接用懸浮的菌液作為pcr的模板加上primer dntp和酶 buffer直接搞pcr
pcr的條件要有所改變
我的經驗是把第一步的保溫時間延長到20min,可以破壞掉細胞.
然後迴圈的時間照舊.
（僅供參考）
菌落pcr的時候退貨溫度該怎樣設定
11樓：匿名使用者
菌落pcr的退火溫度最好設定成梯度降溫形式：比如，從65度開始退火，每擴增一個迴圈降0.5度，總共擴增30個迴圈。
因為菌落裂解後，含有細菌的總dna，容易出現非特異性擴增，梯度降溫能夠顯著提高特異性擴增，減少非特異性擴增。至於退火溫度的起始以及梯度設定等要視具體情況而定。
此外應注意，退火之前的變性時間應稍微延長，以保證菌體充**解。
您好，看了您之前對菌落pcr問題的回答，覺得受益匪淺，有個問題想請教一下
12樓：士誠小人也
陽性對照就是肯定能擴出帶的
陰性對照就是不加模板，應該肯定擴不出條帶的一般按情況來確定設定哪個對照
如果你總是什麼都擴不出，那就多做一個陽性對照如果對擴增結果有懷疑，那就做陰性對照，這個比較常見，主要是檢測試劑是否被雜dna汙染了
13樓：
菌p不需要什麼對照 有就是有 沒有就是沒有 只要一開始pcr擴出來的是目的條帶 菌p就不可能沒有
datuner pro具體操作方法是怎麼樣？右側的字母表示什麼意思？左側的呢？我是新手，很多東西不懂，麻煩你
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