1樓:天枰小蝌蚪吖
熒光定量pcr會加入帶抄有熒光基團襲的探針,bai探針是能和目的基因結合的單
鏈dudna,如果合成雙鏈dna後,zhi熒光基團就dao會啟用發光,所以實時檢測反應物的熒光強度,反應的就是雙鏈dna的濃度,由於合成雙鏈dna的速率和模板濃度有關,所以和參考曲線比較以後是可以計算出模板的相對濃度,當模板是訊號rna是,其反應的就是基因發達的量。
求助熒光定量pcr,我的實驗組和對照組的目的基因ct值非常相近,但是兩組內參基因的ct值相差5左右,正常嗎
2樓:匿名使用者
肯定不行的。熒光定量pcr通過以內參基因作為標準進行相對定量,即眾所e68a8462616964757a686964616f31333330363736周知的2–δδct 法,(前提是要求在所有測試樣本中恆定表達的已知參照基因,而且表達水平不受研究條件及處理方式的影響)。如果實驗組和對照組的目的基因ct值非常接近(前提是cdna稀釋的倍數一致), 說明二者的目的基因無明顯變化呀。
4.2.3.1 2–δδct (livak) 方法
進行相對基因表達分析普遍採用操作簡便的2–δδct 法,條件是目標基因和參照基
因擴增效率都接近100% 且相互間效率偏差在5% 以內。使用2–δδct 法之前,必須驗
證目標基因和參照基因的擴增效率。
一旦確定目標基因和參照基因有相似且接近100% 的擴增效率,你就可以確定不
同樣本中目標基因表達水平的相對差異,步驟如下:
首先,對所有的測試樣和校準樣本,用內參基因的ct 值歸一目標基因的ct 值:
δct(test) = ct(target, test) – ct(ref, test)
δct(calibrator) = ct(target, calibrator) – ct(ref, calibrator)
其次,用校準樣本的δct 值歸一試驗樣本的δct 值:
δδct = δct(test) – δct(calibrator)
最後,計算表達水平比率:
2–δδct = 表達量的比值
得到的結果是通過參照基因表達水平校準的試驗樣本中目標基因相對於校準樣本
的增加或減少的倍數,用參照基因校準目標基因表達的目的是彌補樣本組織量的差異。
如果目標和內參基因的擴增效率不相近,可以優化或重新設計實驗,或者可以
採用4.2.3.3 節中闡述的pfaffl 法。另外,如果目標基因和參照基因有同樣的擴增效
率,但是擴增效率不等於2,那麼,2–δδct 法的公式可以修正為用實際擴增效率值代
替等式中的2。例如,如果目標基因和參照基因的擴增效率都為1.95,計算公式為
1.95–δδct。
下邊的假定的例子告訴你如何使用2-δδct 法來決定一個目標基因(p53)在腫瘤
和正常卵巢組織的表達的相對水平。
例子:正常和腫瘤組織50ngrna 得到的cdna 用來分析p53(目標基因)和
gapdh(參照基因)。gapdh 用來作為參照是因為以前的研究表明這個基因在正常
和腫瘤組織中沒有差異。
樣品ct p53 (目標基因) ct gapdh (參照基因)
正常(校準樣本) 15.0 16.5
腫瘤(試驗樣本) 12.0 15.9
為了用上面介紹的方法進行相對定量分析,在檢測和校準的樣品中靶基因的ct
值和內參的ct 值進行歸一化:
δct(正常) = 15.0 – 16.5 = –1.5
δct(腫瘤)= 12.0 – 15.9 = –3.9
然後,試驗樣本的與校準樣本的δct 值進行歸一化
δδct = δct(腫瘤)– δct(正常)
= –3.9 – (–1.5) = –2.4
最後,計算表達比率:
2–δδct = 2–(–2.4) = 5.3
因此,腫瘤細胞的p53 表達水平比正常細胞高5.3 倍
希望能幫上你。
3樓:匿名使用者
你的實驗組和度招租的模板濃度不一樣吧,那樣內參基因的ct值肯定是不一樣的!
4樓:匿名使用者
正常的,因為你提取兩個材料的rna的量不同。你根據資料算下表達量具體是差幾倍,看是否與你的預期相符
請教qrt-pcr資料統計問題
5樓:匿名使用者
這樣算:
你先把幾次試驗的對照組的平均值設為1, 再把每個單獨試驗對照組的數值算出和這個對照組平均值的差異,就可以計算標準差了。
這麼簡單的統計分析,用不著spss吧, excel就可以解決了。
6樓:匿名使用者
rt-qpcr由普通pcr技術發展而來,它是在傳統pcr反應體系中加入熒光化學物質(熒光染料或者熒光探針),根據各自不同的發光機制實時檢測pcr退火、延伸過程中熒光訊號變化來計算pcr每個迴圈中產物的變化量,目前最常見的方法為biog染料法熒光染料法和biog探針法。
7樓:life實驗室
老師們好,「你先把幾次試驗的對照組的平均值設為1, 再把每個單獨試驗對照組的數值算出和這個對照組平均值的差異,」那麼δδct = δct實驗組樣品 - δct對照組樣品,這裡的「δct對照組樣品」用的應該是平均值還是單個的測定值,假如測定的是不同部位(根、莖、葉),每個部位都有對照,用的應該是根、莖和葉所有對照的平均值還是其他?
您好,我想問一下實時熒光定量pcr的資料分析!
8樓:傻蛋嘟嘟
用2-△△ ct法算的話,應如何算?
假設檢測a基因,ct分別為(這裡記住ct越大,表明相對含量越低)普通組/test1:28
實驗組1/test2:29
實驗組2/test3:30
這時候要設對照了,假設test1為對照組(普通組),當然是以普通組為對照
那麼,相對含量為:
普通組/test1:1
實驗組1/test2:2^-(28-29)=1/2=0.5實驗組2/test3:
2^-(28-30)=1/4=0.25a基因在實驗組1和實驗組2中的表達量,分別下降2倍和4倍!
所以,就出來啦,結果
對於每組不同部位的比較的話,將其中一個處理為1進行比較嗎?
如實驗組1
testis
brain
liver
muscle
可以把任何一個作為1,作為對照,但是要在figure 的legend中註明出來,說清楚就好了!
那對於三個組中的同一部位的比較的話,難道也要將其中一組處理為1嗎?
是的,可以,如
brain
普通組/test1
實驗組1/test2
實驗組2/test3
就以普通組/test1,為對照組,設為1,其他為相對含量,也要在figure 的legend中註明出來說清楚!
9樓:匿名使用者
這個很簡單。你把普通組的某個部位的相對量設為1。其他的,不管是組內的,還是組間的,都用△△ct的方法算出相對量。
再進行比較。基本概念就是設一個點為基點,其他的都是相對值。不要每比一次都設一個1。
熒光定量pcr實驗相對定量法中的rq代表什麼意義
10樓:北京索萊寶科技****
rq:relative quantity,相對錶達量
rq min和rq max是置信區間,計算有點複雜,一般用不到,做圖一般用均值加標準差。
熒光定量pcr裡的相對定量裡算delta deltact的對照組是什麼?
11樓:匿名使用者
你都有標準曲線了。就不用做delta deltact了,直接用樣本的ct值帶入標準曲線就可以了。
delta deltact只用於相對值的測量。每一個delta代表ct值相減一次。第一次是目標基因對照組和實驗組的ct值相減。第二次是內參基因對照組和實驗組ct值相減。
得到的兩個數值算為2的xx次方,就是相差了多少倍。再用目的基因的倍數除以內參基因的倍數,最後得到實際的相差倍數。
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