1樓：惟鏞
rt-pcr和一般的pcr相比原理上沒有太多的區別，無非就是在反轉時候rna的定量，不同模板的設定。對引物沒有特別的要求，能特異代表目的基因就行。
real-time pcr根據原理的不同，引物選擇也不同。通常用的是sybr green的方法，這種方法引物在rt-pcr的基礎上需要注意：1.
退火溫度同內參；2.片段長度不要超過200；
real-time pcr的引物可以跑rt-pcr，反之不一定。
2樓：匿名使用者
rt-pcr就是將rna先反轉錄為cdna，在將轉錄得到的cdna作為模板進行pcr反應擴增目標片段。用於反轉錄的引物根據實驗的具體情況選擇隨機引物、oligo dt及基因特異引物的一種。對於短的不具有髮卡結構的真核細胞mrna三種都可。
隨機引物：適用於長的具有髮卡結構的rna。適用於rrna、mrna、trna等所有rna的轉錄反應。主要用於單一模板的rt-pcr反應。
oligo dt：適用於具有polya尾巴的rna。（原核生物的rna、真核生物的 oligo dt rrna和trna不具有polya尾巴。
）由於oligo dt要結合到polya 尾巴上，所以對rna樣品的質量要求較高，即使有少量降解也 會使全長cdna合成量大大減少。
基因特異引物：與模板序列互補，適用於目的序列已知的情況。
實時pcr也就是qpcr的基本原理與pcr也是一樣的，只是在體系中加入熒光指示，可以對pcr的模板進行定量。
一種是加入熒光染料sybr green，sybr green會嵌入雙鏈dna的小溝，且只有在嵌入小溝時才會發出熒光，熒光定量pcr沒進行一個迴圈就會對產物進行一次檢測，通過檢測每個迴圈後熒光強度（間接得知dna的量）從而檢測整個pcr的過程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析。sybr green不具有特異性，對結果稍有影響。
另一種是加入熒光探針taq man，pcr擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收；pcr擴增時，taqman探針在pcr體系中會與目標片段雜交，而在pcr的extension階段taq酶以一條鏈為模板合成目標片段，此時taq酶的5'－3'外切酶活性將結合在模板上的探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光訊號，即每擴增一條dna鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光訊號的累積與pcr產物形成完全同步。taq man 特異性強，只有被擴增出目標片段時，才有熒光發出，但是**昂貴。
3樓：匿名使用者
一樓的~real-time pcr不就是rt-pcr嗎？！實時定量pcr
普通rt-pcr與實時熒光定量pcr的引物有什麼區別？
4樓：常映寒黃彥
區別
如果rt-pcr的擴增產物只有1,200bp，而且足夠保守可以定位熒光pcr的目的基因
那就可以通用
5樓：奉俏麗奈鯨
實時定量的引物設計要求比較高,可以按普通引物設計的方法來做,但是設計時要注意擴增的片段不能太大,最好在250bp-100bp之間.同時要保證這對引物有絕對的特異性,因為要是產生非特異性擴增的話,就不能準確的計量模板量了,這樣就失去了實時定量的意義了
6樓：僪文賦板惠
普通rt-pcr是半定量的。。即需要從條帶的亮度判斷量的相對多少。。
熒光定量pcr是定量的。。
因為兩者反應體系，要求有很大區別，引物通常不能通用。除了上面提到的熒光定量pcr產物要控制在60-200nt之間，退火溫度也比較高。。一般要達到60度
普通rt-pcr與實時熒光定量pcr的引物有什麼區別
7樓：匿名使用者
實時定量的引物設計要求比較高,可以按普通引物設計的方法來做,但是設計時要注意擴增的片段不能太大,最好在250bp-100bp之間.同時要保證這對引物有絕對的特異性,因為要是產生非特異性擴增的話,就不能準確的計量模板量了,這樣就失去了實時定量的意義了
rt-pcr和pcr引物設計為什麼會有不同
8樓：南京金益柏生物科技****
rt-pcr的核心還是pcr，模板是cdna，只不過這個cdna是rna反轉錄來的~~~ncbi上給的是cdna的序列
pcr,rt-pcr,實時熒光定量pcr的區別與聯絡
9樓：永恆的瞬間綻放
1、所說的pcr應該就是最常規的pcr，以dna為模板，通過上下游引物，實現dna的擴增。
2、rt-pcr一般情況下是指反轉錄pcr（reverse transcription），儘管有些資料上說實時熒光定量pcr也（realtime fluores-cence quantitative pcr）也簡稱rt-pcr，但是這是不對的，不推薦。
基本操作過程是將所提取的rna進行反轉錄，然後將所獲得的cdna作為模板，設計引物進行擴增，是一種檢測基因表達的常用方法。
3、實時熒光定量pcr也就是real-time pcr，其最大的作用是檢測樣品中的初始dna濃度。
至於三者的關係，rt-pcr和實時定量pcr應該都屬於pcr，在rna實驗中，這二者都會應用到。
例如你要比較2個組織中的某基因的表達差異，首先你要提取2個組織的總rna，然後通過rt-pcr檢測該基因是否在2個組織中有表達，然後通過實時定量pcr測定該基因在2個組織中的表達量是否具有顯著性差異。
擴充套件資料：
pcr原理
dna的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈dna在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在dna聚合酶的參與下，根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子拷貝。
在實驗中發現，dna在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制dna的變性和復性，加入設計引物，dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因的體外複製。
但是，dna聚合酶在高溫時會失活，因此，每次迴圈都得加入新的dna聚合酶，不僅操作煩瑣，而且**昂貴，制約了pcr技術的應用和發展。
耐熱dna聚合酶-taq酶的發現對於pcr的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個迴圈加酶，使pcr技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，pcr技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。
pcr技術的基本原理類似於dna的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。pcr由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：
①模板dna的變性：模板dna經加熱至93℃左右一定時間後，使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；
②模板dna與引物的退火（復性）：模板dna經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板dna單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：dna模板-引物結合物在72℃、dna聚合酶（如taqdna聚合酶）的作用下，以dntp為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板dna鏈互補的半保留複製鏈，重複迴圈變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的「半保留複製鏈」，
而且這種新鏈又可成為下次迴圈的模板。每完成一個迴圈需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
rt-pcr的原理是什麼？有何用途？
10樓：禁封
rt-pcr有兩種解釋：
1，最常用的理解：rt 是『逆轉錄』（reverse transcription）的縮寫
2，現在也有人這麼用：rt是『實時』（real time）的縮寫
1，先說逆轉錄pcr：
這項技術使用的『逆轉錄酶』來自逆轉錄病毒，是一種能按照鹼基互補配對原則，以脫氧核糖核苷酸為底物，以寡居dt為引物，把mrna轉換成相應dna的酶，由於該酶的效果與中心法則（dna所承載的生物資訊表達順序應該是dna-rna-蛋白）順序相反，故而有'逆轉錄'之稱。
由於逆轉錄反應使用了引物和模板，也是聚合酶鏈式擴增的（pcr是『鏈式擴增反應』polymerase chain reaction 的縮寫）故稱為rt-pcr。
再說其用途：
我們提取的rna主要是rrna，即核糖體rna，但很少有人用它做些什麼，倒是含量較少的mrna，即信使rna是中心法則所述的遺傳資訊表現的中轉站，所以我們要把微量的信使rna搞出來，更重要的是，rna太容易分解了，環境中無處不在的rna酶啊，以及其容易被水解的特點啊，讓你不得不盡快把珍貴的信使rna轉化成穩定的形式，於是就有了rt-pcr。
2， 再說實時pcr
細胞瞬時轉錄的mrna種類頗多，各種mrna含量也有實時的改變，這反映了細胞核內轉錄因子根據環境要求在做出相應的變化，realtime-pcr，以及quantitative realtime-pcr （簡稱qrt-pcr）就應運而生。
原理：利用pcr高度的特異性，通過特定的引物能在複雜樣品中得到的特定序列的dna，而這種特定dna的產量跟反應初始階段模板量是直接相關的。簡單說來。
經過一個pcr迴圈，可以把一個模板變成兩個，在經過一個迴圈，就會變成四個，以此類推。如果pcr的檢測線是1000個產物，那麼當你的初始樣品中模板是n個，那就需要經歷的迴圈數為
的時候才能檢測，這就把迴圈數與初始樣品中模板數聯絡起來了。也就是說經過計算，達到檢測限的迴圈數就能反映初始rna樣品中某種rna的含量多少。
在實際中，使用了特殊的含有熒光劑的引物，光學檢測相應光強度的產物所需的迴圈數，能高度靈敏的達到目的。
realtime-pcr有兩種。絕對定量和相對定量。
絕對定量常用於逆轉錄病毒侵染細胞的檢測，比如你想知道有多少hiv侵染了樣本中的t細胞，你可以收集一定數量的t細胞並提取rna，通過逆轉錄，以及taq酶利用hiv的特異引物進行擴增，最終的迴圈數可以反應你的這群t細胞正在被多少個hiv侵染。
相對定量常用於檢測實時的轉錄譜，例如在給藥前後，某重要基因轉錄的實時變化，可以分別收取給藥前後的全rna，用相對轉錄量不變的基因為內參，如gapdh或beta-actin，與目標基因轉錄的轉錄量對比，來定量反應藥物對目的基因轉錄含量的影響。一氣呵成，難免有錯，看著玩吧
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用專門的試劑盒來做吧，然後按照說明書操作，挺方便的。我們實驗室以前用的biog熒光定量pcr試劑盒，反應挺靈敏的，實驗結果也不錯，而且染料法和探針法都有。可以用引物設計軟體，primer5就挺不錯的。你是要檢測dna還是rna？探針法檢測dna的話可以用biog super probe kit，檢測...